"Più di ogni altra scienza, la botanica è la poesia del nostro pianeta e della varietà dei viventi ch'esso ospita."
— Alessandro Minelli, L'Orto botanico di Padova 1545–1995, 1995.
Il Rinascimento è un periodo di grande innovazione per quanto riguarda lo studio della botanica. Inizialmente l'insegnamento delle materie botaniche è limitato alla "lettura dei semplici", ovvero alla sola conoscenza delle proprietà mediche delle piante. Gli antichi testi di botanica spesso riportano illustrazioni errate o distorte dell'esemplare botanico, di conseguenza il riconoscimento risulta molto difficoltoso ed è facile incorrere in errori, anche fatali, nell'uso delle piante medicinali.
Pseudo Apuleio, De herbarum virtutibus, Mandragora (sx) e Mandragora femina (dx), XV sec. (Fonte: Phaidra).
In questo contesto, Francesco Bonafede, professore di medicina e reggente della prima cattedra di "lettura dei semplici" all'Università di Padova, sente l'esigenza di praticare uno studio dal vero delle piante le cui proprietà mediche illustra ai suoi studenti durante le lezioni.
Nel 1543 espone al Magistrato dei Riformatori dello Studio di Padova la necessità di istituire un orto pubblico al fine di coltivare piante medicinali. La sua richiesta viene accolta due anni più tardi e il 29 giugno 1545 viene fondato l'Orto botanico di Padova.
L'Orto sorge su un'area vicina al convento di Santa Giustina, ceduta dai monaci Benedettini il 7 luglio 1545. La pianta della struttura viene progettata da Andrea Moroni di Bergamo, che allo stesso tempo presiede anche alla costruzione del vicino tempio di Santa Giustina, mentre l'esecuzione viene sorvegliata dal professor Pietro da Noale, dal patrizio veneziano Daniele Barbaro e, dal 1546 in poi, da Luigi Squalermo detto Anguillara. Quest'ultimo viene posto alla direzione dell'Orto botanico dal 1546 al 1561, diventando suo primo prefetto.
Noto naturalista e precedente professore di materie mediche a Bologna, Luigi Anguillara compie viaggi in Italia e in Oriente, in cui esegue osservazioni sulle specie e redige numerosi trattati sui Semplici. Per la gestione dell'Orto, nel 1547 chiede che i rifiuti di Padova vengano portati nel giardino botanico per utilizzarli come concime e ordina la costruzione di un ponte edificato nella parte interna, chiamato delle Priare.
Nel 1561 l'incarico di prefetto viene affidato a Melchiorre Guilandino di Königsberg (Melchior Wieland). Uomo di cultura e noto naturalista, viaggia più volte in Siria, in Grecia e in Egitto. In una delle sue spedizioni viene catturato e reso schiavo dai pirati algerini per poi essere riscattato dal suo collega e amico Gabriele Falloppio. Nel 1564 gli viene affidato il ruolo di "leggere, mostrare e dichiare" (Notolini 2018) i Semplici. Nasce così un nuovo insegnamento definito "Ad Ostensionem Simplicium", la prima vera cattedra di botanica. Nel 1575 Guilandino fa costruire un idroforo per l'approvvigionamento idrico dell'Orto dal fiume Alicorno attraverso un sistema di tubi sotterranei.
Nel 1603 a diventare prefetto è il botanico e medico Prospero Alpino di Marostica. Compie un viaggio in Egitto durato tre anni verso la fine del Cinquecento. Qui esegue molteplici osservazioni sulla natura del luogo e sulla medicina e i costumi degli abitanti. Tornato in Italia pubblica i risultati del suo viaggio nelle opere De Medicina Aegyptiorum, Rerum Aegyptiarum libri IV (pubblicata postuma) e in De plantis Aegypti. In quest'ultima opera è contenuta la descrizione di una cinquantina di specie officinali usate nella medicina egiziana del tempo, tra cui la pianta del caffè (Coffea arabica L.). Scopre e descrive altre specie, soprattutto di Creta, e pone un'attenzione particolare alle piante della sua zona nativa, fra cui una Campanulacea (Campanula alpini L. = Adenophora lilifolia Bess.).
I suoi viaggi e le sue esplorazioni portano un enorme contributo alla varietà di esemplari botanici dell'Orto. A lui, inoltre, si deve la diffusione del caffè in Italia.
A partire dal 1638, durante la prefettura di Giovanni Veslingio (Johann Wesling), vengono introdotte nell'Orto specie provenienti dalla Spagna, dall'Egitto e dalle Indie per un totale di più di 2000 esemplari. Inoltre, Veslingio fa sì che Ignazio Des-Champs, botanico fiammingo, venga mandato a pubbliche spese in Oriente. Con questa spedizione vengono portate in Italia quasi trecento tra semi e piante vive.
Nel 1649, il nuovo prefetto è il medico padovano Giorgio Della Torre. Durante il suo mandato, fa eseguire numerose opere murarie, come la prima "conserva" per la coltivazione delle piante provenienti dai paesi caldi nel 1659, la riparazione del tetto della casa del prefetto e la restaurazione dell'idroforo. Nel 1685 pubblica De Historia plantarum, una vasta trattazione in cui si contempla la pianta in sé e nelle sue applicazioni nell'arte medica.
Altra figura che contribuisce alle modifiche strutturali è l'abate Felice Viali, prefetto dal 1687. Avvia la costruzione di vasche zampillanti, i pilastri che danno accesso al giardino e i corrispettivi acroteri, le statue dei botanici dell'antichità ed i busti di Fabio Colonna e Gian-Antonio Saraceno. Fa piantare un bosco ed importa numerose piante dalle Indie.
Ulteriori aggiunte all'Orto botanico si devono a Giulio Pontedera, noto come trattatista interessato soprattutto alla sessualità delle piante. Dal 1719 è alla guida dell'Orto; tra i suoi interventi si annoverano la costruzione di due serre maggiori e due minori e di due forni per riscaldare le "conserve mobili". Viene, inoltre, incaricato dalla Serenissima di scrivere una storia dell'Orto che però resta frammentaria. Linneo lo definisce botanico filosofo e gli dedica il genere Pontederia che identifica piante acquatiche o anfibie dei paesi tropicali delle quali una specie (Pontederia crassipes Mart. = Eichornia speciosa Kuth) prospera nell'Orto botanico.
Alla morte di Pontedera nel 1757, l'incarico di reggere la prefettura fino alla nomina del nuovo professore di botanica viene affidato al giardiniere Pietro Arduino. Nei tre anni successivi, Arduino pubblica lo Specimen animadversionum botanicarum in due parti (1759 e 1764) nelle quali condensa osservazioni su piante nuove o rare da lui scoperte in Veneto o ricevute da corrispondenti, tra cui Linneo. Quest'ultimo gli dedica il genere Arduina (diventato sez. del genere Carissa) ed una labiata coltivata nell'Orto fin dai tempi di Pontedera, la Teucrium Arduini. Arduino passa poi alla Direzione della cattedra di Agraria.
Nel 1760 la prefettura passa al botanico Giovanni Marsili (vedi la mostra virtuale Giovanni Marsili: la biblioteca del Prefetto dell'Orto botanico di Padova). In questo periodo, si assiste a un ritorno all'epoca precedente a Pontedera caratterizzata da una maggiore attenzione alle piante medicinali, da una stasi della ricerca scientifica e dall'applicazione di una tassonomia e una classificazione prelinneana. Nonostante il suo maggiore interesse verso l'esercizio della pratica medica rispetto alla botanica pura, Marsili è il primo botanico di Padova ad interessarsi di crittogame. Marsili, inoltre, si adopera molto per l'Orto; si occupa infatti del restauro degli edifici e dell'innalzamento del terreno per contrastare alluvioni. Inoltre istituisce l'arboretum dell'Orto botanico su un appezzamento di terreno destinato all'uso privato del prefetto. Giovanni Marsili è maggiormente conosciuto per la sua ricca raccolta di libri comprendente classici greci e latini, grandi erbari illustrati, opere di medicina ed anatomia, testi di zoologia, geografia, viaggi d'esplorazione e di letteratura contemporanea, libri sulle antichità, sugli usi e costumi passati e presenti. Questa collezione curata fin dalla giovinezza viene poi acquistata dal suo successore Giuseppe Antonio Bonato.
Bonato, laureato in medicina e bibliotecario dell'Università, viene incaricato di succedere a Marsili nel 1794. Avvia interventi di restauro con la riparazione del muro di cinta dell'Orto, della casa del prefetto e di quella dei giardinieri e fa costruire tre grandi serre. Nel 1820, fa trasferire quattro busti lapidei rappresentanti le stagioni dalla Biblioteca Universitaria all'Orto. Ha una grande cura delle collezioni presenti nell'Orto e si adopera per il loro accrescimento. Allestisce un considerevole erbario, i cui esemplari sono facilmente riconoscibili grazie alla presenza di un cartellino descrittivo secondo la classificazione linneana. Poco prima della sua morte, nel 1835 Bonato lascia in eredità la sua biblioteca, comprendente la collezione di Marsili, con l'intento di metterla a disposizione degli studiosi, e nasce così la biblioteca dell'Orto botanico aperta al pubblico.
Nel 1836 il botanico dalmata Roberto De Visiani diventa prefetto dell'Orto botanico. Compie un'intensa attività scientifica, costellata da opere che spaziano dalla botanica alla paleobotanica. A lui si deve la celebre Flora Dalmatica frutto di esplorazioni e ricerche compiute durante i suoi anni giovanili nella sua terra natia. Compie numerosi viaggi ed accresce notevolmente la quantità di esemplari dell'Orto. Organizza inoltre il fondo librario donato da Bonato in una biblioteca aperta a tutti gli studiosi. Prende parte alle attività di manutenzione dell'Orto curando le piante e ripristina le strutture danneggiate dal nubifragio del 1834 a Padova. Tra le varie migliorie, fa costruire la serra per la Palma di Goethe e nel 1842 l'aula "Emiciclo", destinata all'insegnamento di botanica che fino ad allora si teneva presso altre sedi dell'Università.
Nel corso degli anni i prefetti si sono adoperati per accrescere lo splendore dell'Orto botanico di Padova. Con il progresso della scienza si è passati da un "Orto dei Semplici", dedicato esclusivamente alle piante medicinali, ad un Orto botanico in senso stretto, destinato allo studio della botanica pura.