Nel 1598 il nobile padovano Francesco Gasparini, insieme alla moglie Giuliana e alla figlia Virginia, fondò per testamento un luogo «a guisa di monastero» destinato all'accoglienza delle fanciulle povere, che fu chiamato delle Zitelle Gasparine, per distinguerlo da quello delle Zitelle del Vescovo, un istituto di simile finalità voluto dal vescovo di Padova Marco Cornaro negli stessi anni (Portenari 1623, p. 484).
L'edificio fu costruito nella contrada del Pozzo della Vacca (che sarebbe poi divenuta contrada delle Zitelle, dal nome dell'ente), nelle proprietà del Gasparini e vi venne annessa una chiesa intitolata alla Santissima Trinità, sulla cui facciata è una targa che ricorda il fondatore.
Il conservatorio si mantenne conforme alla prima istituzione fino all'anno 1825, quando fu trasformato in un collegio per educarvi ragazze nobili. All'epoca i suoi ambienti contavano tre ampi dormitori, tre stanze ad uso di aule scolastiche, stanze per le maestre e gli amministratori dell'istituto e un refettorio e vi trovavano ospitalità 30 fanciulle.